1、掌握PCR法擴(kuò)增目的基因片段的基本原理與方法；

　　2、通過(guò)PCR驗(yàn)證目的基因片段是否插入質(zhì)粒中；

　　3、充分理解本學(xué)期三次分子實(shí)驗(yàn)的原理、聯(lián)系與意義。

 

　　實(shí)驗(yàn)原理：

　　分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)基本原理：

　　PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增一定長(zhǎng)度的DNA片段。可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。

　　在高溫（94℃）下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫（37～55℃）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在普通Taq酶的最適溫度（72℃）下，以引物3’端為合成的起點(diǎn)，以d NTP為原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過(guò)一次解鏈、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進(jìn)行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)25～30個(gè)循環(huán)后，理論上可使基因擴(kuò)增10 倍以上。